2024年のノーベル生理学・医学賞は線虫から「マイクロRNA」を発見した米マサチューセッツ大学のビクター・アンブロス教授（70歳）と、米ハーバード大学のゲイリー・ラブカン教授（72歳）に


米マサチューセッツ大学のビクター・アンブロス教授（70歳）


米ハーバード大学のゲイリー・ラブカン教授（72歳）

（タイトル）

2024年のノーベル生理学・医学賞は線虫から「マイクロRNA」を発見した米マサチューセッツ大学のビクター・アンブロス教授（70歳）と、米ハーバード大学のゲイリー・ラブカン教授（72歳）に

（本文）

　スウェーデンのストックホルムにあるノーベル賞の選考委員会は、2024年10月7日午後6時半（日本時間）、2024年のノーベル生理学・医学賞に、ヒトの遺伝子の働きを制御することができるマイクロRNA分子を発見したアメリカ・マサチューセッツ大学のビクター・アンブロス教授と、ハーバード大学のゲイリー・ラブカン教授の二人を選んだことを発表した。

　アンブロス教授らは線虫が成長するときの遺伝子の活動を詳しく解析し、マイクロRNAという分子が遺伝子の働きを制御していることを突き止めた。

　その後の研究でマイクロRNAは、ヒトでも遺伝子の働きを制御していることがわかり、現在ではヒトのDNAには1000を超えるマイクロRNAがあることがわかっている。

　マイクロRNAの働きが異常になると、がんの発生につながる可能性も指摘されているほか、臓器や骨が形づくられるときに、異常が起きることも明らかになっている。この功績で、二人は2008年に、アメリカで最も権威のある医学賞とされるラスカー賞を受賞した。

　ノーベル賞の選考委員会は二人の功績について「ヒトを含む多細胞生物にとって不可欠である、遺伝子制御の全く新しい原理を明らかにした。生命体がどのように発達し、機能するかにおいて、『マイクロRNA』は根源的に重要であることが証明されつつある」と説明している。

マイクロRNAの発見と転写後遺伝子調節におけるその役割

　染色体に蓄えられた情報は、体内の全細胞の取扱説明書に例えることができる。すべての細胞には同じ染色体が含まれているため、すべての細胞にはまったく同じ遺伝子のセットとまったく同じ指示のセットが含まれている。しかし筋肉細胞や神経細胞など、さまざまな細胞タイプには、非常に明確な特徴がある。これらの違いはどのように生じるのか。その答えは、各細胞が関連する指示のみを選択できるようにする遺伝子制御にある。これにより各細胞タイプで正しい遺伝子セットのみが活性化される。

　Victor AmbrosとGary Ruvkunは、さまざまな細胞タイプがどのように発達するかに興味を持っていた。彼らは、遺伝子調節に重要な役割を果たす新しいクラスの小さなRNA分子であるマイクロRNAを発見した。彼らの画期的な発見は、ヒトを含む多細胞生物にとって不可欠であることが判明した遺伝子制御の全く新しい原理を明らかにした。現在、ヒトゲノムは1000を超えるマイクロRNAをコードしていることが知られている。彼らの驚くべき発見は、遺伝子制御のまったく新しい側面を明らかにした。マイクロRNAは、生物がどのように発生し、機能するかにとって根本的に重要であることが証明されている。

基本的な規制

　今年のノーベル賞は、細胞が遺伝子活性を制御するために利用する重要な制御メカニズムの発見に焦点を当てている。遺伝情報は、DNAから転写と呼ばれるプロセスを経てメッセンジャーRNA(mRNA)に流れ、その後、タンパク質産生のための細胞機構に流れる。そこでは、mRNAが翻訳され、DNAに保存された遺伝的指示に従ってタンパク質が作られる。20世紀半ば以降、最も基本的な科学的発見のいくつかが、これらのプロセスがどのように機能するかを説明してきた。

　私たちの臓器や組織は、多くの異なる細胞タイプで構成されており、そのDNAに同一の遺伝情報が保存されている。しかし、これらの異なる細胞は、ユニークなタンパク質のセットを発現した。これはどのように可能なのか。その答えは、遺伝子活性を正確に制御して、特定の細胞タイプごとに正しい遺伝子セットのみが活性化されるようにすることにある。これにより、例えば、筋細胞、腸細胞、およびさまざまな種類の神経細胞が、それぞれの特殊な機能を果たすことができる。さらに、遺伝子活性は、細胞機能を私たちの体や環境の変化に適応させるために、絶えず微調整する必要がある。遺伝子の調節がうまくいかないと、がんや糖尿病、自己免疫などの重篤な病気につながる可能性がある。したがって、遺伝子活性の制御を理解することは、何十年にもわたって重要な目標であった。


DNAからmRNA、タンパク質への遺伝情報の流れの図
DNAからmRNA、タンパク質への遺伝情報の流れ。私たちの体内のすべての細胞のDNAには、同一の遺伝情報が保存されている。そのためには、遺伝子活性を正確に制御し、特定の細胞タイプごとに正しい遺伝子セットのみが活性化されるようにする必要がある。

　1960年代には、転写因子と呼ばれる特殊なタンパク質がDNAの特定の領域に結合し、どのmRNAが産生されるかを決定することで遺伝情報の流れを制御できることが示された。それ以来、何千もの転写因子が同定され、長い間、遺伝子調節の主要な原理が解明されたと信じられていた。しかし、1993年に今年のノーベル賞受賞者は、新しいレベルの遺伝子調節を説明する予想外の発見を発表した。進化を通じて非常に重要で保存されていることが判明。

小さな線虫の研究が大きなブレークスルーにつながる

　1980年代後半、ビクター・アンブロスとゲイリー・ルヴクンは、シドニー・ブレナーとジョン・サルストンとともに、2002年にノーベル賞を受賞したロバート・ホロヴィッツの研究室の博士研究員であった。ホロビッツの研究室では、比較的控えめな体長1mmの回虫、C.エレガンスを研究しました。C.エレガンスは、その小さなサイズにもかかわらず、より大きく複雑な動物にも見られる神経細胞や筋肉細胞など、多くの特殊な細胞タイプを持っており、多細胞生物の組織がどのように発達し成熟するかを調べるための有用なモデルとなっている。Ambros氏とRuvkun氏は、さまざまな遺伝子プログラムの活性化のタイミングを制御し、さまざまな細胞タイプが適切なタイミングで発生するようにする遺伝子に興味を持っていた。彼らは、発生中の遺伝的プログラムの活性化のタイミングに欠陥を示す2つの突然変異株、lin-4とlin-14を研究しました。受賞者たちは、変異した遺伝子を特定し、その機能を理解したいと考えていました。Ambrosは以前に、lin-4遺伝子がlin-14遺伝子の負の調節因子であるように見えることを示していた。しかし、lin-14の活動がどのようにブロックされたかは不明でした。アンブロスとルヴクンは、これらのミュータントとその潜在的な関係に興味をそそられ、これらの謎を解くために着手した。


(A)C.エレガンスは、さまざまな細胞タイプがどのように発生するかを理解するための有用なモデル生物です。(B) AmbrosとRuvkunは、lin-4とlin-14の変異体を研究した。Ambrosは、lin-4がlin-14の負の調節因子であるように見えることを示しました。(C)Ambrosは、lin-4遺伝子がタンパク質をコードしない小さなRNA、microRNAをコードしていることを発見した。Ruvkunはlin-14遺伝子をクローニングし、2人の科学者はlin-4マイクロRNA配列がlin-14 mRNAの相補的な配列と一致することに気づいた。

　ポスドク研究の後、ビクター・アンブロスはハーバード大学に新しく設立された研究室でlin-4変異体を分析した。系統的なマッピングにより、遺伝子のクローニングが可能になり、予想外の発見につながった。lin-4遺伝子は、タンパク質産生のコードを欠く異常に短いRNA分子を産生した。これらの驚くべき結果は、lin-4由来のこの小さなRNAがlin-14の阻害に関与していることを示唆していた。

　Gary Ruvkunは、マサチューセッツ総合病院とハーバード大学医学部に新しく設立された研究室でlin-14遺伝子の制御を調査した。遺伝子調節が機能することが知られていた方法とは異なり、Ruvkunは、lin-4によって阻害されるのはlin-14からのmRNAの産生ではないことを示。この調節は、タンパク質産生の停止を通じて、遺伝子発現の過程の後の段階で起こるように思われた。実験により、lin-14 mRNAには、lin-4による阻害に必要なセグメントも明らかになった。2人の受賞者は、彼らの発見を比較し、画期的な発見をもたらしました。短いlin-4配列は、lin-14 mRNAのクリティカルセグメントの相補的な配列と一致しました。AmbrosとRuvkunは、lin-4マイクロRNAがmRNAの相補配列に結合してlin-14をオフにし、lin-14タンパク質の産生を阻害することを示すさらなる実験を行った。これまで知られていなかったタイプのRNAであるマイクロRNAによって媒介される遺伝子制御の新しい原理が発見されたのです。その結果は、1993年にCell誌の2つの記事に掲載されました。

　発表された結果は、当初、科学界からほとんど耳をつんざくような沈黙で迎えられた。結果は興味深いものであったが、遺伝子調節の異常なメカニズムはC.エレガンスの特異性と考えられており、人間や他のより複雑な動物には関係ない可能性が高いと考えられていた。その認識は、2000年にRuvkunの研究グループがlet-7遺伝子によってコードされる別のマイクロRNAの発見を発表したときに変わった。lin-4とは異なり、let-7遺伝子は高度に保存されており、動物界全体に存在していた。この論文は大きな関心を集め、その後数年間で数百種類のマイクロRNAが同定されました。今日、ヒトにはさまざまなマイクロRNAの遺伝子が1000以上存在し、マイクロRNAによる遺伝子制御は多細胞生物の間で普遍的であることがわかっている。


Ruvkunは、マイクロRNAをコードする第2の遺伝子であるlet-7をクローニングしました。この遺伝子は進化の過程で保存されており、現在ではマイクロRNAの制御が多細胞生物の間で普遍的であることがわかっている。

　新しいマイクロRNAのマッピングに加えて、いくつかの研究グループによる実験により、マイクロRNAがどのように産生され、制御されたmRNAの相補的な標的配列に送達されるかのメカニズムが解明された。マイクロRNAの結合は、タンパク質合成の阻害またはmRNAの分解につながる。興味深いことに、単一のマイクロRNAが多くの異なる遺伝子の発現を調節することができ、逆に、単一の遺伝子が複数のマイクロRNAによって制御されることで、遺伝子のネットワーク全体を調整および微調整することができる。

　機能的なマイクロRNAを作製するための細胞機構は、例えばウイルス感染から植物を保護する手段として、植物と動物の両方で他の低分子RNAを作製するためにも採用されている。2006年にノーベル賞を受賞したAndrew Z. Fire氏とCraig C. Mello氏は、細胞に二本鎖RNAを追加することで特定のmRNA分子が不活性化されるRNA干渉について説明した。

生理学的に極めて重要な微小RNA

　Ambros氏とRuvkun氏によって初めて明らかにされたマイクロRNAによる遺伝子制御は、何億年も前から行われてきた。このメカニズムにより、ますます複雑化する生物の進化が可能になった。遺伝子研究から、細胞や組織はマイクロRNAなしでは正常に発達しないことがわかっている。マイクロRNAによる異常な制御はがんの原因となる可能性があり、ヒトではマイクロRNAをコードする遺伝子の突然変異が見つかっており、先天性難聴、眼疾患、骨格障害などの症状を引き起こしている。マイクロRNA産生に必要なタンパク質の1つに変異が生じると、DICER1症候群(さまざまな臓器や組織のがんに関連するまれではあるが重篤な症候群)が発生る。

Ambros氏とRuvkun氏による小型線虫C.elegansの独創的な発見は予想外であり、すべての複雑な生命体に不可欠な遺伝子制御の新たな次元を明らかにしました。


マイクロRNAの独創的な発見は予想外であり、遺伝子制御の新たな次元を明らかにした。

科学的背景:マイクロRNAの発見と転写後遺伝子調節におけるその役割

　ビクター・アンブロスは1953年、アメリカ・ニューハンプシャー州ハノーバー生まれ。1979年にマサチューセッツ工科大学(MIT)で博士号を取得し、1979年から1985年までポスドク研究に従事した。1985年にマサチューセッツ州ケンブリッジのハーバード大学の主任研究員に。1992年から2007年までダートマス医科大学の教授であり、現在はマサチューセッツ州ウースターのマサチューセッツ大学医学部の自然科学のシルバーマン教授。

　ゲイリー・ルヴクンは1952年、アメリカ・カリフォルニア州バークレー生まれ。1982年にハーバード大学で博士号を取得した。1982年から1985年までマサチューセッツ州ケンブリッジのマサチューセッツ工科大学(MIT)で博士研究員を務めた。彼は1985年にマサチューセッツ総合病院とハーバード大学医学部の主任研究員になり、現在は遺伝学の教授。

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科学的背景

マイクロRNAの発見と転写後遺伝子制御におけるその役割

　単細胞の祖先から多細胞生物が進化し、各細胞タイプが特殊な機能を獲得したため、遺伝子制御のメカニズムはますます高度化する必要がありました。調節配列に作用するDNA結合因子によって媒介される転写遺伝子制御に加えて、複雑化が進む生物が進化するにつれて、他の形態の制御系が出現しました。何億年にもわたって、小さなノンコーディングRNA分子をコードする遺伝子、いわゆるマイクロRNAが多細胞生物のゲノム内で増殖し、mRNAの安定性とタンパク質翻訳に対する転写後制御を行使しました。マイクロRNAとその遺伝子制御の様式は、1993年にビクター・アンブロスとゲイリー・ルブクンによって発見されるまで、まったく知られていませんでした。2人のノーベル賞受賞者は、lin-4およびlin-14遺伝子座の変化によって引き起こされた発生障害を持つ突然変異型線虫C.elegans線虫を調査しました。Ambrosの研究室はlin-4遺伝子をクローニングし、それがタンパク質をコードしていないという驚くべき発見をしました。代わりに、短い22ヌクレオチドノンコーディングRNAをコードしていました。これと並行して、Ruvkun氏の研究室では、lin-4が3'非翻訳領域(3'UTR)の複数の要素を介してlin-14を制御していることを明らかにしました。配列情報を比較した結果、短いノンコーディングlin-4 RNAとlin-14の3'UTR要素との間に部分的な配列相補性があることが明らかになりました。これにより、概念的に新しいタイプの制御性RNA、すなわちマイクロRNAを初めて垣間見ることができました。2000年、Ruvkun氏の研究室は、高度に保存されたlet-7 microRNAを発見し、その後、ヒトを含む多様な動物種にわたる相同マイクロRNAの同定につながりました。これをきっかけに、動物界全体でマイクロRNAを同定するためのクローニングとシーケンシングが盛んに行われ、その結果、マイクロRNAはタンパク質をコードする遺伝子の広大なネットワークを制御する大規模な調節因子グループを包含していることがわかりました。Ambros氏とRuvkun氏による発見は全く予想外であり、マイクロRNAが媒介する進化的に保存された転写後調節メカニズムを明らかにし、動物の発生と成体組織機能に重要な役割を果たしていることを明らかにしました。

紹介

　各遺伝子をいつ、どこでRNAに転写し、タンパク質に翻訳するかを制御することは、生命の基本的な側面です(図1)。たとえば、インスリンは膵島のベータ細胞で産生されますが、オプシンは眼の網膜で産生されます。細胞種特異的な遺伝子の精密な制御の指示は、遺伝物質自体にコードされ、配列特異的なDNA結合タンパク質によって作用されます。フランソワ・ジャコブとジャック・モノは、遺伝子がどのように制御されているかを発見したことで、1965年にノーベル生理学・医学賞を受賞しました。DNA結合転写因子のレパートリーは、単細胞および多細胞の真核生物の間で良好に保存されていますが(King et al., 2008)、多細胞生物内では、各細胞型でいつでもRNAとタンパク質の正しい産生を確保するために、遺伝子調節の追加層が出現しています。


DNAからmRNA、タンパク質への遺伝情報の流れの図
図 1.細胞型特異的機能の制御。すべての細胞には同一の染色体セットが含まれているため、まったく同じ遺伝子セットが含まれています。細胞型特異的な機能は、これらの遺伝子の選択されたサブセットのみが各細胞型内で活性化されるときに発生します。© ノーベル生理学・医学委員会。イリノイ州マティアス・カールレン

　真核生物のモデル生物は、遺伝子研究において非常に貴重な存在であり、多くの予想外の発見をもたらしてきました。シドニー・ブレナーは、50年以上前に線虫Caenorhabditis elegans(C.エレガンス)を紹介しました。この生物の短い世代時間、透明性、および遺伝子操作の容易さは、広範な研究を促進しました。Sydney Brenner、John Sulston、Robert Horvitz は、C. elegans を使用して、臓器発生中に細胞分裂、分化、細胞死が遺伝的にどのように制御されているかを解明し、2002 年にノーベル生理学・医学賞を受賞しました。

　1970年代に、ブレナー研究室で行われたC.エレガンスの突然変異誘発スクリーニングにより、lin-4変異体(e912)が発見されました。これらの線虫は顕著な表現型を示しました:多くの細胞タイプと形態学的構造が完全に欠如し、外陰部の発達の失敗により卵が蓄積されました（図2)(Horvitz and Sulston、1980;Chalfie, Horvitz and Sulston, 1981)、特定の細胞系譜に対する発生プログラムの反復から来ているようです。

l　in-4変異体で観察された線虫の発達の大きな混乱は、lin-4が発生タイミングのマスターレギュレーターをコードしていることを示唆しています。ホロビッツ研究室で発見された第2の変異体lin-14を含む、種々の時間的発達障害を示す多数の追加の異時性変異体が特徴づけられた(Ferguson, Sternberg and Horvitz, 1987)。


異時性線虫の突然変異体の写真
図 2.発生上の欠陥を持つ異時性線虫の変異体。動物の発生を混乱させた線虫lin-4およびlin-14変異体。変異体のlin-4線虫は、外陰部を形成することなく細胞系統が内部の卵子を蓄積するための発生プログラムを繰り返しますが、lin-14変異体は小さく、幼虫の発達を欠いています。(Ambros、2008)から適応されたワーム
一方、Victor Ambrosは、David Baltimoreとともにポリオウイルスのゲノム構造と複製に関する博士号を取得した後、Horvitz研究室に加わりました。ポスドクとして、Ambrosはすぐに異時変異体の遺伝子解析に着手し、lin-14がlin-4変異体で観察されたものとは逆の発生タイミング欠陥を持っていることを特定しました（図2)。lin-14変異体では、幼虫プログラムは完全に存在しませんでした(Ambros and Horvitz、1984)。注目すべきは、Ambrosが後にlin-4がlin-14の負の調節因子であることを発見したことです(Ambros, 1989)。

　この期間中、ゲイリー・ルヴクンはフレデリック・アウスベルの監督下で細菌遺伝学の博士号を取得していました。ヨーロッパを旅行中に、彼は異時変異体の細胞系統解析について学んだ後、線虫の遺伝学に興味を持つようになりました(Chalfie、Horvitz and Sulston、1981;Ruvkun、Wightman and Ha、2004)。その後、Martin ChalfieとRobert Horvitzとの議論が、これらの問題を調査するためにC.エレガンスを使用することへの彼の関心をさらに高めました。1982年、ルヴクンはウォルター・ギルバートとロバート・ホロヴィッツの研究室で共同でポスドク研究を開始しました。

マイクロRNAによる転写後遺伝子制御の発見

　ホロビッツ研究所では、アンブロスとルヴクンがlin-14のクローン化を長く追求し始めました。当時、遺伝学によって定義された遺伝子座のDNA配列を特定することは困難な作業でした。何年にもわたる粘り強い実験の後、彼らは古典的な制限フラグメント長多型アプローチを使用して領域を特定することに成功しました(Ruvkun et al., 1989)。この期間中、アンブロスとルヴクンはともに、アンブロスはハーバード大学、ルヴクンはマサチューセッツ総合病院とハーバード大学医学部で教員の地位を得た。自分たちの疑問に向き合いながら、彼らは分子解析を続けました。Ruvkunは、lin-14が発生段階でステージ特異的に発現し、L1ステージで高発現し、lin-4およびlin-14変異体で変化する核タンパク質であることを示しました(Ruvkun and Giusto、1989)。興味深いことに、3'UTRに欠失を持つlin-14機能獲得変異体が発見されました(Ruvkun and Giusto, 1989;Wightman et al., 1991)、L1ステージを超えてlin-14タンパク質の検出が延長されることにつながった(Arasu, Wightman and Ruvkun, 1991;Wightman et al., 1991)。3'UTR要素の破壊はタンパク質配列に影響を与えなかったため、Ruvkunは、mRNAの安定性、核外輸送、または翻訳に作用する転写後メカニズムがlin-14の時間スイッチを媒介している可能性が高いと仮定しました(Wightman et al., 1991)。

　同定されたいくつかのlin-14変異体とは対照的に、lin-4では1つの変異体しか発見されていなかった(e912)。Ambros研究室は、制限フラグメント長多型とサザンブロットプローブによって導かれて、lin-4遺伝子のクローニングに着手しました。「染色体に沿って歩き」、変異型lin-4表現型を救う能力について小さなゲノム断片を繰り返しテストすることで、693 bpのSal l制限酵素フラグメントを特定しました。オープンリーディングフレームの予測とクローンの再シーケンシングを繰り返してエラーを排除した後、彼らはlin-4遺伝子が短いオープンリーディングフレーム(ORF)配列のためにノンコーディングRNAであるのではないかと疑い始めました。C.エレガンス配列に導入されたフレームシフト変異は、lin-4の機能に影響を与えず、この疑念を裏付けています。1991年、研究室はノーザンブロットおよびRNase保護アッセイによるlin-4転写産物の探索を開始し、長さが61ヌクレオチド(nt)の2つの短いRNA転写産物を明らかにしました(図3)。


2つの短いlin-4転写産物の同定の画像。
図 3.2つの短いlin-4転写産物の同定。野生型、lin-4 (e912) 変異体、および Sal I フラグメントでレスキューされた lin-4 (e912) 変異体からの全 RNA のノーザンブロットを、放射性標識 lin-4 RNA プローブでプローブし、U6 ローディングコントロールと比較しました。(リー、ファインバウム、アンブロス、1993)。

　lin-4(Ambros研究室)とlin-14(Ruvkun研究室)の配列を独立して推定した後、1992年6月11日の夕方、AmbrosとRuvkunはlin-4とlin-14遺伝子の配列データを交換しました。両者とも、lin-4ノンコーディングRNAとlin-14 3'UTRの複数の要素との間に顕著な部分相補性があることに気づきました(図4)。

　彼らの観察の重要性を認識した2つの研究室は、lin-4マイクロRNAが3'UTRに位置する要素との塩基対形成を通じてlin-14 mRNAを制御していることを実証する一連の追加の実験を行いました。彼らの独創的な発見は、1993年にCell誌に立て続けに発表された2つの論文で報告されました(Lee, Feinbaum and Ambros, 1993;Wightman, Ha and Ruvkun, 1993)。


図 4.lin-4およびlin-14 RNAの相補的な配列要素。lin-4とlin-14のクローニング配列を比較したところ、短い22 ntのlin-4 RNAは、lin-14 3'UTRの反復要素に対して部分相補性を有することが明らかになりました。

　Ambrosの研究室では、C.エレガンスlin-4配列を使用して、他の線虫種(C.briggsae、C.remanei、C.vulgaris)に対応するlin-4を含むクローンを同定しました。これらの実験により、他の線虫由来のlin-4クローンが、C.エレガンスのlin-4変異体表現型を救うことができることが実証されました。また、20,000以上の変異原性染色体をスクリーニングし、1塩基変異を含む2つ目のlin-4変異体(ma161)を同定した。特に、この変異は相補配列内に存在し、lin-4マイクロRNAとlin-14 3'UTR要素との間の相補塩基の機能的意義をさらに支持しました(Lee、Feinbaum、Ambros、1993)。

　Ruvkunの研究室では、野生型およびlin-14機能獲得変異体におけるlin-14タンパク質とRNAの量を調査しました。変異体中のlin-14タンパク質は4倍から7倍に上昇し、RNA量に差はなく、lin-14が転写後レベル(すなわち、RNAが転写された後)で制御されていることを示しました。lin-14 3'UTRをレポーター遺伝子に導入すると、lin-14と同様のレポーター遺伝子の転写後制御が起こり、異種3'UTRがmRNA翻訳を制御するのに十分であることが実証されました。繰り返し、lin-14 3'UTRの小さな断片をレポーターに移し、機能的な124 nt長の3'UTR断片が同定されました。この3'UTR領域には、lin-4と部分的に相補的な配列がいくつか含まれており、さらにこの領域はC. briggsaeに保存されていました(Wightman, Ha and Ruvkun, 1993)。

　新たに発見されたlin-4マイクロRNAを全種のヌクレオチド配列の包括的なデータベースに照らして計算解析したところ、他のCaenorhabditis線虫(C. briggsaeなど)の間でのみ一致する配列が明らかになりました。マイクロRNAの存在は線虫に特有の特異性だったのか、それとも動物界全体に広範囲にわたる機能的影響をもたらして保存されていたのか、という重要な疑問が残っていました。

進化的に保存されたlet-7マイクロRNAの発見

　最初のマイクロRNAであるlin-4の画期的な発見に続き、2番目のマイクロRNA遺伝子であるlet-7が同定されるまでに7年が経過しました。Ruvkun研究室は、lin-14およびegl-35遺伝子座の両方で突然変異を持つ株の合成無菌表現型を抑制する突然変異体に焦点を当てた遺伝子スクリーニングを実施しました(Reinhart et al., 2000)。Let-7は、lin-14、lin-28、lin-41、lin-42、daf-12など、さまざまな異時性遺伝子の3'UTRに対して相補性を示す短い21-nt RNAをコードすることがわかりました。let-7の喪失は、成虫期における幼虫細胞の運命の反復につながった。第2のマイクロRNA遺伝子の発見は、マイクロRNAが発生中の細胞系譜形成の段階特異的なタイミングを調節する上でより広範な役割を果たす可能性があることを示唆しています。

　次のブレークスルーは、Ruvkun研究室がlet-7遺伝子がlin-4とは異なり、幅広い動物にわたって進化的に保存されていることを発見したときに訪れました。let-7マイクロRNA配列をヌクレオチドデータベースと比較すると、ショウジョウバエとヒトの両方で配列が一致していることが明らかになりました(Pasquinelli et al., 2000)。線虫におけるlet-7の同定された標的の1つは、ゼブラフィッシュおよびショウジョウバエのオルソログを有するタンパク質であるlin-41(Reinhart et al., 2000)であった。心強いことに、ゼブラフィッシュとショウジョウバエの両方のlin-41オルソログの3'UTRは、let-7と相補性を示しました(Pasquinelli et al., 2000)。さらに、let-7マイクロRNAはいくつかのヒト組織で発見され、一般的な哺乳類細胞における遺伝子発現との関連性を示しています。

　線虫と同様に、ショウジョウバエの発生の解析では、let-7 microRNAの時間的調節が示され、昆虫、甲殻類、線虫の間でlet-7が果たした役割が保存されていることが示唆されました(Pasquinelli et al., 2000)。驚くべきことに、幼虫の状態を通じて発達しない種である軟体動物および環形動物の成体期でも、let-7の時間的発現が検出されました(Pasquinelli et al., 2000)。さらに、脊椎動物は明確な幼虫期を持っていませんが、成体のゼブラフィッシュでの強い発現を含め、発生中に時間的に調節されたlet-7発現を示します。驚くべきことに、let-7の発現は、左右対称の動物である二国間動物の間で時間的に制御されていることがわかり、これらの動物が二葉芽球種、つまりヒトや他の脊椎動物のように3つではなく2つの主要な胚葉から発生する種から分岐した後に進化した可能性があります(図5)。進化的に高度に保存されたlet-7の発見は、遺伝子発現の転写後調節因子としてのマイクロRNAへの関心を大いに高めました。


図 5.let-7 RNA発現とマイクロRNAの進化的保存、より一般的に。左:後生動物の進化系統樹で、検出可能なlet-7マイクロRNA発現(+)またはlet-7発現が検出されなかった系統樹(-)の枝を強調表示しています。let-7 RNA発現の類似した発生パターンを持つ種は(初期段階ではlet-7はなく、成体期までにlet-7が発現する)ことは「Dev.」で示されています。(Pasquinelli et al., 2000)。右:マイクロRNA遺伝子は、5億年以上にわたって多細胞生物のゲノム内で進化し、拡大してきました。

　let-7の発見後、いくつかの研究室では、small RNAクローニングを通じて、ヒトや他の種における追加のマイクロRNAの同定を模索しました。Thomas Tuschlの研究室では、ヒトおよびショウジョウバエの組織から新規のmicroRNAをクローニングし(Lagos-Quintana et al., 2001)、David Bartelの研究室では線虫から新しいmicroRNAを単離し(Lau et al., 2001)、Ambrosの研究室では(Lee and Ambros, 2001)が単離しました。その結果、膨大な種類の制御性マイクロRNAが動物全体に存在し、遺伝子調節に重要な役割を果たしている可能性が高いという、説得力のある証拠が得られました。それ以来、分子生物学とシーケンシング技術の進歩により、ヒトゲノム中の1,000を超えるマイクロRNA遺伝子が同定されました。現在、マイクロRNA遺伝子のデータベースであるmiRBaseは、271の生物にわたる38,000以上のヘアピン前駆体と48,860の成熟マイクロRNA遺伝子配列で構成されています(Kozomara, Birgaoanu and Griffiths-Jones, 2019)。ウイルスでさえも、マイクロRNA遺伝子をコードすることがわかっています(Pfeffer et al., 2004)。

　追加のマイクロRNAのクローニングと全ゲノム配列の利用可能性は、マイクロRNAと3'UTR領域との間の塩基対形成規則を定義する機会の増加を示しました。David Bartel、Christopher Burge、Stephen Cohenの研究室で実施された重要な研究(Lewis et al., 2003;Stark et al., 2003;Brennecke et al., 2005;Lewis, Burge and Bartel, 2005)は、実験的および比較ゲノミクスアプローチを組み合わせて、マイクロRNA標的認識の全体的なルールを解明しました。これらの研究は、マイクロRNAが典型的には、主にマイクロRNAの「シード」領域において、標的mRNAに対して部分的な相補性を有することを示しました。また、この研究により、多くの3'UTRはマイクロRNAシード配列に相補的な配列を過剰に保存しているため、各マイクロRNAが複数のタンパク質コード遺伝子を制御している可能性が高いことも明らかになりました(Brennecke et al., 2005;Lewis、Burge and Bartel、2005)。興味深いことに、細胞型または系統特異的なマイクロRNAと共発現する遺伝子には、その特定のマイクロRNAの標的部位がありません。対照的に、このようなマイクロRNAの標的部位は、隣接する細胞や組織で発現する遺伝子によく見られます(Farh et al., 2005;Stark et al., 2005)。これらの観察結果は、マイクロRNAが多細胞生物の細胞系譜形成と細胞型の安定性に重要な機能を持っているという仮説を補強しました。

マイクロRNAの生合成と機能

　追加のマイクロRNA遺伝子のクローニングと並行して、いくつかの研究グループによる集中的な努力がマイクロRNAの生合成と作用機序の理解に注がれました(Bartel、2004年)。マイクロRNA遺伝子転写の戦略はさまざまです。多くのマイクロRNA遺伝子は独立した転写単位であり、クラスター化されている場合もあれば、タンパク質をコードする遺伝子のイントロン内に存在しているものもあります。標準的な初代マイクロRNA(pri-microRNA)は、RNAポリメラーゼIIによって転写され、ヘアピン構造の配列を特徴としています。このヘアピンは、Droshaエンドヌクレアーゼを含むヘテロ三量体複合体であるマイクロプロセッサーが核内で処理するための基質として機能し、両方の鎖を切断して、通常60〜70ヌクレオチドの長さの前駆体マイクロRNA(pre-microRNA)を生成し、Ambrosラボで最初に検出されました(図2)。Exportin 5およびRAN-GTPは、細胞質へのプレマイクロRNA輸送を促進します。その後、Greg Hannonの研究室(Bernstein et al., 2001)で同定されたエンドヌクレアーゼであるDicerによるプロセシングにより、マイクロRNA二本鎖が形成されます。有効なmicroRNA鎖は、Argonauteタンパク質含有サイレンシング複合体にロードされますが、もう一方の「パッセンジャー」鎖は置換されます(Schwarz et al., 2003)。マイクロRNA鎖がサイレンシング複合体にロードされると、翻訳やmRNAの分解を減少させることで、mRNAの配列特異的な負の調節を行うことができます。この制御には、アダプタータンパク質TNRC6とポリ(A)結合タンパク質PABPCが関与しており、mRNAポリAテールを短縮するデッドデニラーゼ複合体を動員し、細胞の状況(発生段階や細胞タイプなど)に応じてmRNAの分解と翻訳阻害をもたらします。

　マイクロRNA機能を処理および実行する機械は、一般にRNA干渉(RNAi)として知られる他のRNAベースのサイレンシングメカニズムにも使用されます。これらには、低分子干渉RNA(siRNA)、内因性piwi関連RNA(piRNA)、および反復結合低分子干渉RNA(rasiRNA)が含まれます。二本鎖RNAが配列依存性遺伝子サイレンシングを誘導できるという発見(Fire et al., 1998)により、Andrew Z. FireとCraig C. Melloは2006年のノーベル生理学・医学賞を受賞しました。RNAiは主にウイルス感染(植物およびより複雑性の低い動物)および望ましくないゲノム移動要素活性に対する防御メカニズムとして機能しますが、マイクロRNAは発生全体および成体細胞タイプ全体でmRNAに対して転写後制御を発揮します。この目的のために、マイクロRNAは、各mRNAターゲットに対するそれぞれの効果を「調整」するために、ターゲットmRNA配列に対して部分相補性を進化させてきましたが、例えば、siRNAはしばしば外因性であり、切断される特定のRNAターゲット配列に対して完全な相補性を持っています。1999年、David Baulcombeは、植物における転写後遺伝子サイレンシングには、標的配列に特異的な短いRNAの処理が含まれることを示しました(Hamilton and Baulcombe、1999)、さまざまな分野での観察をさらに結び付けました。

マイクロRNAの進化とその生理的役割

　マイクロRNA遺伝子の出現と拡大は、より複雑な生物の進化と密接に関連しています(図5)。マイクロRNA遺伝子の数は、初期の二国間進化の間に著しく増加しました(Grimson et al., 2008;Wheeler et al., 2009)、それらの機能的役割は、プロトストームと後口動物の分岐に先立つ最後の共通の二国間祖先で推論されました(Christodoulou et al., 2010)。それ以来、複雑な生物のより特殊な細胞タイプや組織の進化により、何百ものマイクロRNA遺伝子が追加されています。マイクロRNA遺伝子は、初期の後生動物スポンジ、植物、および2つの単細胞真核生物種でも同定されています。したがって、マイクロRNAは、約6億年前の多細胞動物の初期の系統を含め、進化の過程で複数回出現した可能性や、植物と動物の両方の祖先がすでに10億年前にマイクロRNAを進化させた可能性があります(Moran et al., 2017)。特に、進化的に古いマイクロRNA遺伝子の多くが、後に進化した生物に保存されていること、そしてこれらの遺伝子が進化によって失われることがほとんどないという事実は、遺伝子調節におけるそれらの重要な役割を示しています。

　後生動物の発生および組織機能におけるマイクロRNAの本質的な役割は、マイクロRNA生合成経路の成分のアブレーションを通じて実証されています。細胞質でpre-miRNAを処理するDicerの喪失は、マウスやゼブラフィッシュでは胚的に致死的です(Bernstein et al., 2003;Wienholds et al., 2003)。ショウジョウバエやマウスのマイクロRNA遺伝子の個々のまたはグループの除去も、強い表現型を引き起こします(Bartel、2018年)。しかし、個々のマイクロRNA遺伝子の役割は、標的を定義するシード配列を共有する複数のマイクロRNA遺伝子の重複した役割が原因である可能性があります。このシステムの冗長性は、単一のマイクロRNA遺伝子の機能を研究する上での障壁となりますが、システムの堅牢性も示しており、ウイルスなどによって簡単に操作できない理由も説明しています。

　マイクロRNAの基本的な役割を強調するためには、最も進化的に保存されたマイクロRNA遺伝子、つまり二国間生物間で共有される遺伝子は胚発生の初期に機能しているのに対し、哺乳類で特異的に進化したマイクロRNAは胚発生の後期に機能することに注意することが重要です(DeVeale, Swindlehurst-Chan and Blelloch, 2021)。対照的に、種特異的なマイクロRNA遺伝子は、一般に、胚発生ではなく成体細胞型で役割を果たします。これらのパターンは、さまざまな進化的保存のマイクロRNA遺伝子に対する体系的なノックアウト実験から明らかです。動物発生におけるマイクロRNAの特異的な制御役割には、発生のタイミング、細胞運命の形成と安定性、一般的な生理機能、恒常性などがあります(DeVeale, Swindlehurst-Chan and Blelloch, 2021)。

　成体細胞や組織におけるマイクロRNAの機能は、トランスジェニックマウスにおける選択的Dicer除去によって解明されています。B細胞の成熟期にDicer1を早期に除去すると、プロB細胞の段階で分化が停止しました(Koralov et al., 2008)。ニューロンにおける胚15.5日目のDicer1アブレーションは、小頭症に先行する出生後早期の死亡、樹状突起枝の精緻化の減少、および樹状突起棘の長さの増加をもたらしました(Davis et al., 2008)。有糸分裂後の小脳プルキンエ細胞では、2週齢でのDicer1の喪失が小脳変性および運動失調の発症(非協調的な筋肉運動)を引き起こしました(Schaefer et al., 2007)。同様に、中脳のドーパミン作動性ニューロンにおけるDicer1の喪失は、進行性のニューロン喪失と自発運動活動の低下につながりました(Kim et al., 2007)。他のいくつかの細胞タイプや組織で重度の表現型が観察されており、発生過程と成体細胞型機能の両方におけるマイクロRNAの重要な役割が実証されています。

　ヒトの発生と機能に対するマイクロRNAの重要性は、特定のマイクロRNA遺伝子または生合成経路の構成要素の突然変異に関連する症候群を通じて明らかになります。DICER1症候群は、DICER1遺伝子の変異によって引き起こされるまれな遺伝性疾患であり、腎臓、甲状腺、卵巣、子宮頸部、睾丸、脳、眼、および肺に腫瘍ができやすくなります。多くの場合、DICER1の1つの対立遺伝子には生殖細胞変異があり、機能不全になり、細胞内の機能的なDICER1タンパク質の量が減少します。これらの個人は、追加の体細胞変異に対して脆弱であり、その結果、小児期に腫瘍を発症することがよくあります(Foulkes、Priest and Duchaine、2014)。

　個々のmicroRNA遺伝子の塩基対形成部分(すなわち、シード領域)は短いため、偶然の突然変異によって変更される可能性が低くなります。しかし、マイクロRNA遺伝子のシード配列には、疾患に関連する変異が知られています。これらには、進行性難聴に関連するmiRNA-96の変異が含まれます(Mencía et al., 2009;Soldà et al., miRNA-184 の変異は、虹彩形成不全、内皮ジストロフィー、および先天性白内障を伴うまれな眼疾患である EDICT 症候群を引き起こします (Hughes et al., 2011;Iliff、Riazuddin and Gottsch、2012;Lechner et al., 2013)、およびmiRNA-140-5pの変異が先天性骨格障害を引き起こす(Grigelioniene et al., 2019)。代謝障害、心血管疾患、神経変性疾患、がんなどの疾患に対するマイクロRNAベースの診断法や治療法の開発が進んでいます。

（計量計測データバンク　編集部）

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